腫瘤的分子分型與個性化治療

上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院消化科、同濟消化疾病研究所  郜恒駿

生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的前沿、高新技術(shù)。該技術(shù)將高密度的核酸、蛋白質(zhì)、組織、細胞等包被在硅片、玻片等固相支持物上，故主要分為基因芯片、蛋白芯片、組織芯片與細胞芯片等。通過設(shè)計不同的陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如基因表達譜研究、突變檢測、多態(tài)性分析、分子標記物篩選等，為功能基因組的研究及醫(yī)學診斷學的發(fā)展提供了強有力的工具，將會在新基因的發(fā)現(xiàn)、基因診斷、藥物篩選等方面取得重大突破，為整個人類社會健康帶來深刻而廣泛的變革。

系統(tǒng)生物學（systems biology）與三P醫(yī)學

過去的一百多年，腫瘤研究走進了這樣一個誤區(qū)：腫瘤一直被認為是一個器官的局部病變，直至今天一提到腫瘤，基礎(chǔ)與臨床研究者就會想到腫瘤細胞，對癌癥的研究也變成了癌細胞的研究。事實是腫瘤并不是一堆癌細胞的堆積，癌細胞不是孤立存在的，而是有著嚴密結(jié)構(gòu)的組織，包括間質(zhì)、血管、淋巴細胞、免疫細胞等，癌細胞的研究不等于癌癥的研究。可見，對癌癥的研究也變成了癌細胞的研究顯然不妥。隨著基因組、功能基因組等各種組學的深入研究與高通量生物芯片、高通量RNAi等技術(shù)的迅猛發(fā)展以及能分析海量生物信息數(shù)據(jù)的高性能計算機問世，系統(tǒng)生物學（systems biology）應(yīng)運而生。最新研究成果不斷提示：腫瘤的發(fā)生除腫瘤細胞自身存在眾多的基因表達改變外，它更是一個全身性疾病的局部反應(yīng)，是機體作為一個生物系統(tǒng)的整體平衡失調(diào)的結(jié)果，即腫瘤是一個系統(tǒng)性疾病。其特征是局部細胞的不正常生長，但這是以全身改變?yōu)楸尘暗摹＿@是一個非常重要的問題：因為長期以來, 腫瘤診治未能取得突破的很重要原因是我們對腫瘤的認識出現(xiàn)了問題，如果舊的觀念仍然不改變，在很長的時間內(nèi)，腫瘤治療將很難達到根治。希望國內(nèi)有更多從事腫瘤臨床研究的醫(yī)生能夠一起反思并重視這個問題。系統(tǒng)生物學使得疾病的預(yù)測（Prediction）、預(yù)防（Prevention）或干預(yù)（Preemptive）、分子分型與個性化治療（Personalized therapy）即所謂的三P醫(yī)學以及分子水平早期診斷、預(yù)后評估等走到前臺，具有重大的基礎(chǔ)與臨床研究價值。

個性化治療（Personalized therapy）

臨床上，對于不同個體（如均為成年人），患同樣疾病，醫(yī)生們常常給予他們同樣治療方案、藥物、甚至劑量，事實上，其中有些患者對藥物反應(yīng)好、有些效果一般、另有一些甚至出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)（ADR）。可見，即使患同樣疾病，一種治療方案、藥物及其劑量并不適合所有患者。基因組、HapMap（SNP）與拷貝數(shù)變異（CNV）、功能基因組及其技術(shù)（如高通量生物芯片）快速發(fā)展與應(yīng)用，使得我們清楚的認識到人與人之間存在的差異（可能達10-15%），正因為這些差異導(dǎo)致了人與人之間的千差萬別，包括對疾病的不同易感性（即不同的患病風險）、對藥物的不同反應(yīng)（即不同的療效與副作用）以及疾病的不同預(yù)后。這提示我們在臨床上，對于不同個體（如均為成年人），即使患同樣疾病，醫(yī)生們應(yīng)考慮給予他們不同樣治療方案、藥物或劑量，即所謂的個性化治療。

藥物基因組學（Pharmacogenomics）與營養(yǎng)基因組學（Nutrigenomics）

近年來，腫瘤的診治取得了長足的進展，但在不同病人間存在著顯著的療效和毒副作用的差異。除了環(huán)境等因素外，不同個體的基因組差異是造成療效和毒副作用差異的主要因素。惡性腫瘤治療方法的發(fā)展將很大程度取決于藥物基因組學（Pharmacogenomics）的研究與應(yīng)用。所謂藥物基因組學是研究遺傳因素對病人藥物效應(yīng)的影響，鑒定與藥物療效和毒性相關(guān)的基因改變或基因表達譜、單核苷酸多態(tài)性（SNP）或CNV，其最終目標是根據(jù)患者的遺傳特征（即分子分型，Molecular  Classification）建立最優(yōu)化的治療方案與最合適的劑量，獲得最高的療效，而毒副作用卻最小，使得“量體裁藥”成為現(xiàn)實。藥物基因組學將為我們從消化道腫瘤綜合治療由目前傳統(tǒng)治療模式過度到個性化指明了方向。此外，對腫瘤的防治更為超前的是個性化飲食（Personalized diet）預(yù)防或干預(yù)，即前NIH（國家健康研究所）主任Bernadine Healy博士所描述的：根據(jù)一個人出生后的基因型來確定她應(yīng)該吃什么樣食物，即所謂的營養(yǎng)基因組學（Nutrigenomics）。

   分子分型（Molecular  Classification）的方法與種類

   分子分型的方法與種類常見的歸納如下。DNA水平：檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）或拷貝數(shù)變異(CNV)、DAN甲基化（DAN Methylation / Epigenomics），DNA序列分析（DNA Sequence），比較基因組雜交（CGH）、DNA芯片等；RNA水平：基因表達譜（Gene Expression Profiling，EGP）分析、MicroRNA，RNAi等；組織水平：基于組織或組織芯片（Tissue Microarray，TMA）的分子病理學。其他還有蛋白、抗體檢測或蛋白芯片方法。目前熱門的治療領(lǐng)域還有分子靶向治療（Molecular Targeted Therapy，MTT）。

    分子分型與個性化治療

幾種質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)由肝臟中CYP2C19所代謝。CYP2C19的基因型分為三種：homEM（homozygous extensive   metabolizer)，hetEM (heterozygous extensive metabolizer)和PM（poor metabolizer). 在這三種基因型中PPIs 的pharmacokinetics與pharmacodynamics均不同，治療時血漿PPI與胃內(nèi)pH 水平homEM組最低，而PM組最高。CYP2C19 的不同基因型影響基于PPIs 的療效，如GERD、PU以及H.pylori根除治療。CYP2C19基因型檢測有助于個性化指導(dǎo)確定PPI以及 PPI為基礎(chǔ)的治療方案與治療劑量。

    對27種經(jīng)常導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)的藥物研究發(fā)現(xiàn)：其中59%至少存在1個藥物代謝酶的基因變異而嚴重影響藥物代謝，對照組的變異僅7-22%。基因變異影響藥物代謝動力學是產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)的重要原因。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）仍是目前腸道等惡性腫瘤的基本化療藥物之一，是許多含有新藥的實驗藥物配伍的基本成分之一。5-FU療效相關(guān)的基因檢測已被列入衛(wèi)生部臨床檢驗?zāi)夸浿校?/SPAN>http://www.moh.gov.cn/newshtml/19264.htm）。二氫嘧啶脫氫酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD）多態(tài)性較高，已鑒定遺傳變異有39多個。中國人中，最常見的缺陷等位基因是DPYD*9，頻率為5-14％。該等位基因編碼的DPD酶活性完全缺失，無法代謝5-FU，使用5-FU 時毒副作用會較大，甚至危及生命。5-FdUMP能與胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthase，TS）結(jié)合，影響dUMP與TS的結(jié)合。若TS表達增高，將降低5-FU 療效，進而影響腫瘤患者5年生存率，TS高表達的結(jié)直腸癌患者比低表達者生存期短。胸腺嘧啶合成酶基因（TYMS）中影響其表達的遺傳變異，是造成個體間5-FU療效差異的主要原因之一。通過檢測DPYD和TYMS等基因遺傳變異，有助于提高5-FU療效并降低毒副作用。

   服用依立替康（Irinotecan ，CPT-11）可治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胃及食道癌。治療前需要做UGT1A1基因檢測，其遺傳學檢測已獲美國FDA批準（Marsh S.  Mol Diag Ther, 2007, 11: 79-82.）。人尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP glucuronosyltransferase 1 family， polypeptide A1，UGTIA1）能催化CPT-11的活性形式SN-38為無活性的代謝產(chǎn)物SN-38G，該基因表達差異可造成個體間SN-38G生成能力的差異。UGT1A1*28包含7個TA重復(fù)序列，是UGT1A1基因最常見的變異型，其頻率在亞洲人中為15％。UGT1A1*28腫瘤患者體內(nèi)UGTIA1酶缺乏，在應(yīng)用CPT-11治療時，體內(nèi)SN-38聚集，引發(fā)腹瀉或嗜中性白血球減少癥。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）能催化谷胱甘肽與鉑類藥物結(jié)合，使之失活并增加其水溶性，促使藥物外排，因此與鉑類藥物的細胞內(nèi)耐藥相關(guān)。GSTP1基因第105位異亮氨酸殘基突變成纈氨酸殘基后，奧沙利鉑/5-FU聯(lián)合用藥的生存率顯著提高。在DNA結(jié)合物存在的情況下，X線交錯互補修復(fù)基因1（x-ray repair cross-complementing group 1，XRCC1）的Arg399Gln改變了二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）結(jié)合域的特性，降低了DNA修復(fù)能力。與純合399Arg相比，攜帶399Gln患者接受奧沙利鉑/5-FU治療效果較差，生存期短。

   80%KIT酪氨酸激酶基因突變，最常見位點是外顯子11，其他外顯子9、13和17。5-7%存在PDGFRA突變，為外顯子12和18。10-15%為野生型，無突變。DNA Sequence：可以檢測GIST突變的位點，評估酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（Gleevec）療效，指導(dǎo)個性化治療，外顯子11突變，對甲磺酸伊馬替尼客觀反應(yīng)率70%，400mg/d，增加劑量療效無影響；外顯子9突變，對甲磺酸伊馬替尼客觀反應(yīng)率35%，800mg/d才能獲得較高反應(yīng)率。

檢測宿主遺傳易感性最重要的意義就在于研究疾病的發(fā)病機制。具體到研究H.pylori宿主遺傳易感性的意義而言，其意義則是在以下兩方面：一是機體在受到H.pylori 攻擊時開始發(fā)生損傷，此過程中宿主遺傳易感性起到怎樣的重要作用；二是在由H.pylori誘發(fā)的慢性炎癥過程中，胃生理機制被造成長期損害，而宿主遺傳易感性在其中產(chǎn)生了如何重要的影響。明確宿主遺傳易感性的另一個重要意義是能根據(jù)某些暴露因素（如微生物、化學、飲食、藥物等）來預(yù)測臨床結(jié)局。例如：通過確定宿主遺傳易感性，對那些感染H.pylori后可能發(fā)生萎縮和低酸狀態(tài)者，因為有遺傳學篩查依據(jù)，這些個體就應(yīng)當被列為需要提供根除H.pylori治療的對象。我們構(gòu)建了H.pylori感染宿主胃癌易感性基因聯(lián)合檢測芯片將有助了解不同的個體暴露于危險因素時，其發(fā)生各種不同臨床結(jié)局的風險，判斷胃癌高危個體和H.pylori根除對象，為胃十二指腸疾病，尤其是胃癌預(yù)測、預(yù)防、早期診斷和個性化治療提供新思路。

自荷蘭癌癥研究所首先發(fā)現(xiàn)的與淋巴結(jié)陰性乳腺癌預(yù)后相關(guān)的76個基因表達譜，使鑒別不需要系統(tǒng)治療的低復(fù)發(fā)風險原發(fā)性乳腺癌這一夢想有可能在不遠的將來成為現(xiàn)實。大約70%的乳腺癌患者術(shù)后并不會發(fā)生轉(zhuǎn)移，也就是說這70個左右的基因檢測，決定有70%的患者是不需要術(shù)后輔助治療的。美國FDA提準了這一檢測，使得臨床利用基因表達譜檢測指導(dǎo)個性化治療、預(yù)測預(yù)后成為現(xiàn)實。通過分析文獻報道的對5-FU耐藥的胃癌和結(jié)直腸癌的全基因組基因表達譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌和結(jié)直腸癌中與5-FU耐藥相關(guān)的表達譜是一致的，提示不同腫瘤對5-FU具有相同的耐藥機制。在胰腺癌方面，有研究分析了吉西他濱（gemcitabine）轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)基因?qū)σ认侔┘毎槟退幮纬蛇^程中的表達水平的改變，發(fā)現(xiàn)hENT1 x dCK/RRM1 x RRM2基因表達比率隨著吉西他濱耐藥性的獲得而逐步降低，因此這4個基因表達水平的比率與胰腺癌細胞珠獲得性吉西他濱耐藥相關(guān)，可能是胰腺癌吉西他濱療效的預(yù)測指標。對吉西他濱敏感珠和耐藥珠（KLM1-R）的研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在KLM1-R中高表達，并且KLM1-R敲除HSP27后恢復(fù)了對吉西他濱的敏感性。在胰腺癌病人中，HSP27表達增高與吉西他濱較高的耐藥性相關(guān)，提示HSP27表達檢測可能用于胰腺癌吉西他濱的療效預(yù)測。但這些研究結(jié)果有待于大樣本量的臨床試驗驗證。

   惡性腫瘤個體生物學行為的預(yù)測是臨床醫(yī)生的迫切需求，也是未來分子診斷病理學（Molecular Pathology）面臨的挑戰(zhàn)。基于組織與組織芯片技術(shù)的惡性腫瘤預(yù)測病理學指導(dǎo)個性化治療、預(yù)測預(yù)后成為當今研究的熱點。上海芯超生物承擔了國家發(fā)改委生物芯片上海國家工程研究中心以及十五國家863《功能基因組與生物芯片》——組織生物樣本庫與組織芯片的重大項目。2年來，應(yīng)用自主開發(fā)的芯超高通量組織芯片進行腫瘤預(yù)測等分子病理學研究發(fā)表的論著近50篇，其中有國際著名雜志《Journal of Clinical Oncology》（IF15.484）2篇、《Hepatology》（IF:10.7）5篇、《Cancer Res》（IF:7.672) 1篇、《Clinical Cancer Res》（IF:6.25）1篇、《Oncologist》 (IF: 4.876）1篇、《Cancer》（IF:4.632）2篇、《Autophagy》（IF:4.657）1篇、《J Cancer Res Clin Oncol》（IF:2.366）2篇等，影響因子已經(jīng)超過100分。標志著芯超高通量組織芯片已經(jīng)達到國際先進水平，奠定了中國組織芯片國際品牌的地位。應(yīng)用肝癌組織芯片的合作研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝所致的肝癌術(shù)后，P48基因表達的檢測是決定術(shù)后是否應(yīng)用INF-a治療的重要標記物。TILs、Tregs對術(shù)后肝癌預(yù)后評估及個性化治療措施的制定均有重要的指導(dǎo)作用。癌周組織中MCSF的高表達與肝癌術(shù)后預(yù)后不良密切相關(guān)。CK16與伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌的遠期預(yù)后有關(guān)。

   分子分型與分子靶向治療

   腫瘤發(fā)生、發(fā)展與一些重要的信號傳導(dǎo)（Signal transduction）通路與血管生成（Angiogenesis）密切相關(guān)。抑制或阻斷這些重要的靶點，能有效地抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等酪氨酸激酶生長因子受體及其配體在消化道惡性腫瘤常常表達增高，導(dǎo)致有絲分裂信號通路異常地活化，引起細胞生長失控。這些受體的抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑均能阻斷這些信號通路。分子靶向治療的類型與常用藥物：一種是抗EGFR藥物(EGFR抑制劑:EGFRI)如Gefitinib(吉非替尼，易瑞沙Iressa)、Erlotinib（埃（厄）羅替尼—小分子單抗）、Cetuximab（西妥昔單抗，IMC-C225——大分子單抗）與Nimotuzumab（尼妥珠單抗，泰欣生——人源化抗EGFR大分子單抗 ）等。cetuximab是EGFR的單克隆抗體，與化療或放療聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同作用,具有毒副作用少、靶向性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于消化道惡性腫瘤的治療。近年來的研究顯示，KRAS突變顯著影響結(jié)直腸癌患者cetuximab療效，KRAS突變者表現(xiàn)為對cetuximab耐藥，生存期較差。因此，結(jié)合皮膚反應(yīng)和KRAS突變，可以確認出預(yù)后較差的結(jié)直腸癌患者。另一種是抗血管生成藥物如Bevacizumab（貝伐單抗，Avastin——選擇性的抑制VEGF）、Endostar（恩度，重組人血管內(nèi)皮抑素）與Thalidomide（沙利度胺，反應(yīng)停）等。多靶點抑制如Sorafinib（索拉非尼，名多吉美），抑制Raf/MEK/ERK與VEGFR、PDGFR，Raf酶等多靶點抑制劑索拉非尼對晚期肝癌效果明顯，開創(chuàng)了HCC分子靶向治療新時代。當前，高通量RNAi技術(shù)的問世，可根據(jù)自己的研究思路與研究設(shè)計，一次性地同時干擾數(shù)十個、數(shù)百個基因，這一高通量基因功能的研究工具，將在診斷標記物與治療靶點的篩選中發(fā)揮極其重要的作用。

   分子分型與個性化治療基礎(chǔ)研究值得重視的問題

   臨床專家必要認真思考如何開展分子分型與個性化治療的研究。首先，課題設(shè)計很重要，當今信息化、系統(tǒng)生物學研究時代，需要臨床專家、技術(shù)專家、基礎(chǔ)研究專家，甚至生物信息專家共同設(shè)計課題。接下來至關(guān)重要的是樣本準備很重要，根據(jù)分子分型與個性化治療的研究需要，制訂標準化流程（SOP），并嚴格按照此SOP收集治療前后的組織、血清、血漿、全血等樣本以及相關(guān)重要的實驗室數(shù)據(jù)與臨床資料，這是研究至關(guān)重要的環(huán)節(jié)與源頭，只有這樣研究才能有廣度與深度，結(jié)果才能具有重大的科學與應(yīng)用價值，最終應(yīng)用分子分型結(jié)果指導(dǎo)臨床個性化治療。至于藥物基因組等研究技術(shù)，建議臨床醫(yī)院等研究單位應(yīng)善于整合國家級生物芯片的研究中心，作為自己的共享平臺，為我所用。最后值得重視的問題是，藥物基因組學與生物芯片研究結(jié)果的分析需要臨床專家與生物信息專家共同完成，科學地分析并從海量信息中挖掘有價值的數(shù)據(jù)是艱巨、但是更為重要的工作。